בשנות מלחמת העולם השנייה ביקש בן-גוריון בשהותו בארץ ובעיקר בחוץ לארץ לארגן את שורות הסוכנות היהודית למשימותיה כגוף שיוביל להקמת המדינה היהודית בארץ-ישראל.
בוועידת בילטמור במאי 1942, שהוא היה מיוזמיה המרכזיים, הוחלט לצאת בקריאה מפורשת להקמת מדינת היהודים. במהלך המלחמה דאג להתגברות כוחות ההגנה מתוך הבנה שאלה יעמדו במאבק מול כוחות ערבים שסרבו להכיר בהקמת מדינת ישראל.
בתום המלחמה ביקר בן גוריון במחנות הפליטים באירופה וחזה בתוצאותיה הנוראות של השואה. ביקור זה חיזק בו את ההכרה שיש להחריף את המאבק בשלטון הבריטי. היה מראשי היוזמים לשיתוף פעולה בין ארגוני המחתרת היהודית על ידי ארגון "תנועת המרי העברי".
לאחר המלחמה פעל להכרת אומות העולם בהקמה מיידית של מדינת ישראל, ועמד בראש ההגנה שנאבקה בכוחות צבא פלסטינים שנעזרו בכוחות מחוץ לארץ-ישראל. המערכה המדינית הסתיימה בסופו של דבר בקבלת תוכנית החלוקה באומות המאוחדות בשנת 1947, תוכנית שבן גוריון ראה בה לגיטימציה להכרזה על הקמת מדינת ישראל. באותה שנה מונה לאחראי על תיק הביטחון בהנהלת הסוכנות היהודית.